ВІКІСТОРІНКА
Навигация:
Інформатика
Історія
Автоматизація
Адміністрування
Антропологія
Архітектура
Біологія
Будівництво
Бухгалтерія
Військова наука
Виробництво
Географія
Геологія
Господарство
Демографія
Екологія
Економіка
Електроніка
Енергетика
Журналістика
Кінематографія
Комп'ютеризація
Креслення
Кулінарія
Культура
Культура
Лінгвістика
Література
Лексикологія
Логіка
Маркетинг
Математика
Медицина
Менеджмент
Металургія
Метрологія
Мистецтво
Музика
Наукознавство
Освіта
Охорона Праці
Підприємництво
Педагогіка
Поліграфія
Право
Приладобудування
Програмування
Психологія
Радіозв'язок
Релігія
Риторика
Соціологія
Спорт
Стандартизація
Статистика
Технології
Торгівля
Транспорт
Фізіологія
Фізика
Філософія
Фінанси
Фармакологія


ДНК-зависимые РНК-полимеразы.

Нуклеаза Bal31.

Выделяют из псевдомонады Alteromonas espejiana Bal31.Он обладает эндонуклеазной активностью по отношению к однонитевой ДНК. А так же 3'-экзонуклеазной активностью на двунитевой ДНК. Благодаря чему катализируют отщепление небольших олиго- и мононуклеотидов с обоих концов молекулы. Это позволяет применять данную нуклеазу для укорочения двунитевых фрагментов ДНК на заданную величину и для картирования сайтов рестрикции. Нуклеаза способна делать ник в двунитевой ДНК против ника в комплиментарной цепи.

ДНК-аза1.

Представляет собой эндонуклеазу гидролизующую как одно- так и двуцепочечную ДНК с образованием сложной смеси моно- и олигонуклеотидов, содержащих 5'-фосфатные группы. В присутствии ионов Mg независимо атакует каждую цепь ДНК. При этом места разрывов располагаются статически вдоль молекулы. А в присутствеи ионов Mn расщепляет обе цепи ДНК приблизительно друг против друга.

№2. Экзонуклеазы. Экзонуклеазы действующие на одноцепочечные ДНК, на двухцепочечные ДНК (3’-5' и 5'-3’). Рибонуклеазы (А).

Экзонуклеазы – ферменты, осуществляющие последовательное отщепление моно- или олигонуклеотидов с концов молекул ДНК или РНК.

Экзонуклеаза III E. Coli

Катализирует последовательное отщепление 5'-нуклеотидов из двуцепочечных ДНК в направлении 3'-5'. Фермент обладает эндонуклеазной активностью по отношению к апуринизированной ДНК, также активностью РНК-азы H (гидролиз РНК в РНК-ДНК гибридах) и так же 3’-фосфатазной активностью. В сочетании с ДНК-полимеразой фермент используют для введения в ДНК радиоактивной метки.

Экзонуклеаза фага λ.

Катализирует последовательное отщепление 5'-мононуклеотидов в двуцепочечной ДНК при наличии в них 5'-концевых фосфатных групп. Фермент используют для получения одноцепочечных молекул ДНК с целью их последующего секвенирования.

Рибонуклеаза А.

Обладает активностью эндорибонуклеазы, специфически расщепляющей фосфодиэфирные связи, образованные пиримидиновыми нуклеотидами. Продуктами гидролиза являются 3'-фосфореллированые пиримидиновые моно- и олигонуклеотиды.

№3. Полимеразы. ДНК-зависимые ДНК-полимеразы. ДНК-зависимые РНК-полимеразы. РНК-зависимые ДНК полимеразы. ДНК-лигазы.

Среди ДНК-зависимых ДНК-полимераз наибольшее применение в генной инженерии находят ДНК-полимераза I E.Coli и её большой фрагмент (фрагмент Клёнова), Т4 ДНК-полимераза, термостабильная taq-полимераза. Все эти ферменты в присутствии ионов магния из 4 нуклеотидов осуществляют синтез ДНК, комплементарной мДНК. И для функционирования требуют затравки.

ДНК-полимераза I E.Col.

Состоит из полипептидной цепи и обладает тремя активностями:

1. 5 – 3 полимеразной, 2. 5-3 и 3. 3-5 экзонуклеазной. Большой фрагмент ДНК полимеразы I (фрагмент Клёнова) является частью полипептидной цепи ДНК полимеразы I у которой отсутствует домен, соответствующий 5-3 экзонуклеазе. Как ДНК полимераза I так и её фрагмент используются для введения радиоактивно меченых нуклеотидов в цепь ДНК путём ник-трансляции. Т.е перемещения одноцепочечного разрыва вдоль молекулы двухцепочечной ДНК, в которой 3’-конец используется в качестве затравки. При этом ДНК полимераза I прокладывает себе путь с помощью 5-3 экзонуклеазы. А фрагмент Клёнова вытесняет цепь ДНК с 5'-конца. Кроме того, фрагмент Клёнова используют для синтеза второй цепи кДНК, секвенирования ДНК по методу Сэнгера, заполнения 5'-выступающих липких концов ДНК с образованием тупых концов, введение концевой радиоактивной метки, а так же для удаления 3'-выступающих концов рестрикционных фрагментов ДНК, 3'-5' экзонуклеазы этого фермента.

ДНК-полимераза фага Т4.

Этот фермент обладает теми же активностями, что и Клёновский фрагмент ДНК полимера I E.Coli. Однако 3'-5' экзонуклеазная активность данного фермента существенно более эффективна. Особенно на однонитевых ДНК. Поэтому для введения метки в рестрикты с 3'-выступающими концами лучше использовать эту полимеразу.

Taq-полимераза.

Фермент получают из термофильных бактерий Termus aquaticus. Поэтому он сам термостабилен. Обладает 5'-3' – экзонуклеазной активностью, но 3'-5' экзонуклеазная активность отсутствует. Может работать при температуре 95 градусов в течение часа.

ДНК-зависимые РНК-полимеразы.

РНК-полимеразы фагов T3, T7 Е.Coli. Эти полимеразы высоко специфичны к промоторам собственных фагов. На фоне многих других промоторов они узнают только свои и синтезируют только определённые молекулы мРНК. Это их свойство используют для приготовления меченных гибридизационных зондов и полноразмерных транскриптов для синтеза белков in vitro. Эти РНК-полимеразы обладают высокой процессивностью: выход продукта in vitro в оптимальных условиях составляет 100 молекул мРНК на 1 молекулу ДНК.

РНК-зависимые ДНК-полимераза (ревертаза).

Биологическая роль этой полимеразы заключается в образовании ДНК-копий геномов некоторых РНК-содержащих вирусов. => обратная транскриптаза. Обычно используют фермент, кодируемый вирусом миелобластоза птиц. Он состоит из 2-ух полипетидных цепей, одна из которых несёт экзонуклеазную и 5’-3’ полимеразную активности. Экзонуклеазная активность проявляется только на дуплексах ДНК-РНК. Причём цепь РНК гидролизуется путём последовательного отщепления нуклеотидов с обоих концов цепи. Как полимераза, фермент работает на однонитевых молекулах РНК или ДНК, образуя комплементарные цепи (кДНК), для чего ему требуются праймеры с 3'-ОН концами. С помощью обратной транскриптазы можно синтезировать копию любой части мРНК, выбрав подходящий праймер. Это возможность облегчает анализ строения какого-либо специфического участка генов.

ДНК-лигаза.

Создание фосфодиэфирных связей в одноцепочечных разрывах двуцепочечной ДНК с помощью ДНК-лигаз является наряду с рестрикцией одним из важнейших этапов получения рекДНК in vitro. Наибольшее применение в генной инженерии получила ДНК-лигаза фага Т4. Она осуществляет соединение фрагментов двуцепочечной ДНК, обладающих комплементарными липкими или тупыми концами.

 

№4. Фосфатазы и киназы. Использование в генной инженерии.

Щелочные фосфатазы.

Фосфатазы обладают широкой специфичностью. Они гидролизуют самые различные эфиры фосфорной кислоты. В генной инженерии, используют щелочную фосфатазу из клеток E. Coli и из кишечника телёнка. Первая термостабильна, а вторая инактивируется при 68 градусах. Эти ферменты применяют для дефосфореллирования одно и двунитевых молекул РНК или ДНК на 5'- и 3'-концах, а также для расщепления макроэргических связей дезоксирибонуклеозидтрифосфатов. Их используют при подготовке фрагментов НК к введению 5-концевой радиоактивной метки 32Р и для предотвращения лигирования векторных молекул ДНК самих себя.

Полинуклеотидкиназа фага Т4.

Фермент способен переносить гаммафосфат с АТФ на дефосфореллированные 5- концы. Это свойство используют для введения радиоактивной метки в 5’-концы одно- и двунитевых молекул ДНК и РНК. Если в среде присутствует избыток АДФ, то в этих условиях полинуклеотидкиназа способна замещать концевой 5'-фосфат на гаммафосфат АТФ.

 

 

№5 Векторы на основе репликонов бактериальных плазмид. Суицидные векторы.

Первые векторы для клонирования фрагментов чужеродной ДНК были получены с использованием бактериальных плазмид. Большая серия векторных плазмид, обозначенных символом pBR , создана на основе репликона природной плазмиды ColEI , придающей клеткам E. coli устойчивость к колицину путем его объединения с генами устойчивости к антибиотикам. Бактериальные клетки, несущие подобные комбинированные плазмиды, приобретали устойчивость к соответствующим антибиотикам, и их было легко отличить от бесплазмидных клеток путем простого посева на питательную среду с антибиотиками.

Векторы серии pBR322

Плазмида представляет собой кольцевую ковалентно замкнутую молекулу ДНК длиной 4363 п.о. Последовательность нуклеотидов pBR322 полностью известна. Плазмида содержит гены устойчивости к тетрациклину (Tc) и ампициллину (Ap) , которые были перенесены в плазмиду pBR322 из плазмиды pSC101 и транспозона Tn3 соответственно. Оба этих гена являются селектируемыми генетическими маркерами плазмиды, т.е. позволяют проводить отбор бактериальных клеток с плазмидой pBR322 по их способности к росту на питательных средах в присутствии тетрациклина и (или) ампициллина.

Плазмида pBR322 содержит обеспечивающий ее стабильную репликацию в клетках E. coli участок ДНК, который включает область начала репликации (ori). В плазмиде pBR322 имеются несколько уникальных сайтов рестрикции. Встраивание в плазмиду клонируемых чужеродных фрагментов ДНК по сайтам рестрикции, расположенным в генах Ар или Tc (например, PstI или BamHI ), будет нарушать целостность этих генов и их функциональную активность. В результате происходит утрата бактериальными клетками, содержащими рекомбинантные плазмиды, устойчивости к соответствующим антибиотикам. По такому признаку легко различить бактериальные клетки, не содержащие плазмиды (не растут в присутствии ампициллина и тетрациклина), клетки с плазмидой, не содержащей вставки клонируемой ДНК (растут в присутствии обоих антибиотиков), и клетки с рекомбинантными плазмидами (в зависимости от локализации вставки могут расти на среде только с одним антибиотиков).

Векторы серии pUC

В векторах серии pUC селектируемым маркером является 5'-концевая часть гена бета-галактозидазы E. coli - lacZ'. Эта часть гена, находящаяся под контролем lac-промотора, кодирует N-концевую часть бета-галактозидазы, которая путем объединения с недостающей С-концевой частью полипептида без образования пептидной связи восстанавливает ферментативную активность бета-галактозидазы. Бета-галактозидаза обладает способностью расщеплять искусственный субстрат Xgal (5-бром-4-хлор-3-индолил-бета-D-галактопиранозид) с образованием окрашенного в голубой цвет продукта реакции. В том случае, когда в бактериальных клетках, которые содержат в хромосоме недостающую экспрессирующуюся 3'-концевую часть гена lacZ и выращиваются на среде с Xgal, в результате комплементации альфа-пептидом вектора появляется активность бета-галактозидазы, образованные этими клетками бактериальные колонии окрашиваются в голубой цвет. Уникальные сайты рестрикции для клонирования ДНК локализованы в начале гена бета-галактозидазы в составе полилинкера (синтетической последовательности нуклеотидов, содержащей несколько перекрывающихся уникальных сайтов рестрикции), который не нарушает функциональной целостности последовательности нуклеотидов альфа-пептида. Вставка рекомбинантной ДНК в эти векторы разрывает структурную часть гена бета-галактозидазы и инактивирует его, в связи с чем колонии бактерий с подобными рекомбинантными плазмидами, выросшие на питательной среде с Xgal, не окрашены. Поскольку векторы серии pUC одновременно содержат и ген устойчивости к ампициллину, отбор бактерий, несущих рекомбинантные плазмиды, можно проводить одновременно по двум маркерам. На питательной среде с ампициллином и Xgal вырастают только бактерии, устойчивые к антибиотику, т.е. содержащие плазмиду pUC , а среди выросших колоний лишь неокрашенные содержат вставку чужеродной ДНК.

 

Фазмиды

Содержат в себе ген элементы плазмид и хромосом б/ф ёмкостью характеризующейся для λ-векторов – 15 т п о., они могу существовать в виде плазмид в клетке в определённых условиях, и сразу упаковываются в фаговые частицы при изменении этих условий.

 

№7. Векторы на основе вирусов животных.

Т.к у эукариот (животных) не обнаружено ядерных плазмид, то единственными «донорами» для переноса векторов могут быть вирусы. Вирусы животных плохи для использования потому что:

1. В их геноме нету несущественных областей, которые можно было бы заменить клонированной ДНК. => векторы сконструированные на базе таких вирусов дефектны.

2. Емкость вирусных векторов ограничена, т. к в капсид может упаковываться лишь определённое кол-во ДНК( а гены эукариот очень большие 30 и > пар нуклеотидов).

Вирус SV-40.

Развиваются в клетках обезьяны. Т. к он обладает онкотрансформирующим действием и может нарушить структуру генов, его редко используют для интеграции клонированных генов в клеточные хромосомы. С помощью таких векторов можно наблюдать экспрессию.

Вирус осповакцины.

Обладает двунитевой ДНК, которая имеет уникальное строение. Это линейная молекула на обоих концах которой имеются шпильки, замыкающие ковалентно обе нити ДНК. Привлекателен в качестве вектора, т к:

1. имеет широкий спектр клеток-хозяев. От беспозвоночных до позвоночных.

2. Позволяет внедрять большие фрагменты чужеродной ДНК ( до 25 т п н.), у самого вируса геном 187 т. п. н..

3. Безопасен для использования.

Их используют для создания рекомбинантых вирусов, в геном которых встроены гены кодирующие белки-антигены различных болезнетворных вирусов (микробов), создавая при этом иммунитет к инфекционным заболеваниям.

Ретровирусы.

Обладают однонитевой РНК. Их жизненный цикл обязательно проходит через образование двуцепочечной ДНК. Преимущества:

1. Исключительно широкий круг хозяев.

2. Структура интегрированной ДНК исключает возможность перестройки клонированного в ней гена.

3. Клетки не погибают, а продуцируют вирусы в течение многих генераций.

 

Так же используют:

- аденовирусы;

- бакуловирусы ( инфицируют насекомых).

№8. Векторы для растительных клеток .

Специфика векторов для экспрессии рекомбинантых генов в клетках растений обусловлена главным образом регуляторной последовательностью нуклеотидов, которая обеспечивает эффективную транскрипцию генов в растительных тканях.

Группа векторов DMGT ( DNA mediated gene transfer) осуществляют перенос генов в клетке растений. Для получения линии стабильных растительных клеток, которые содержат рекДНК в интегрированном в хромосоме состоянии и активно экспрессировали его в состав DMGT векторов вводят дополнительные селективные маркеры. Которые придают клеткам включившим экзогенную ДНК определённый фенотип.

Для введения векторов так же используют бактерии Agrobacterium tumefaciens и Agrobacterium rhezogenes – вызывают заболевание «корончатый галл» и «косматый корень» соответственно. Они обладают природной способностью переносить определённые последовательности ДНК в растительный геном в своих плазмидах.

В 80-ых бактерии модифицировали, удалив все онкогены. Эти гены не участвуют ни в переносе, ни в интеграции с ядерной ДНК.

Неонкогенные ТДНК присутствующие в целом регенерировавшем растении передаются потомству. Для идентификации трансформированных клеток встраивают бактериальные гены устойчивости к антибиотикам.

 

№9. Получение библиотеки ДНК с помощью вирусных или плазмидных векторов.

Возможность проведения шотганэкспериментов рассматривалась еще тогда, когда технология рекомбинантных ДНК делала свои первые шаги. Идея амплификации очень сложных смесей фрагментов ДНК и последующего обнаружения одного из них казалась фантастичной, а сейчас она представляется почти банальной. Основной принцип этого подхода состоит в создании коллекции рекомбинантных молекул, составляющих полный геном данного организма (библиотеки рекомбинантных молекул).

По существу, полный нефракционированный набор фрагментов ДНК превращают в соответствующий набор стабильных рекомбинантов, который можно сохранять и многократно использовать для клонирования различных вставок.

При этом применяются Е. соli-системы хозяин-вектор, где в качестве вектора используются плазмиды или бактериофаги, поскольку они более пригодны для получения большого числа рекомбинантных молекул и удобны для хранения.

Наиболее важны два типа библиотек. Одна из них, создаваемая из суммарной геномной ДНК, в принципе должна содержать все гены данного организма. Однако такая цель обычно оказывается недостижимой, поскольку некоторые последовательности ДНК не удается клонировать. Один из вариантов геномной библиотеки представляет собой всю ДНК какой-то одной хромосомы. Для создания такой библиотеки необходимо выделить ДНК из отдельных хромосом. Хромосомы человека фракционируют с помощью методов, аналогичных используемым при сортировке флуоресцирующих и нефлуоресцирующих клеток.

Библиотеки второго типа включают последовательности, составляющие всю мРНК, обнаруживаемую в определенных клетках. В этом случае популяцию мРНК превращают в популяцию молекул кДНК, которые затем клонируют. Геномные библиотеки представляют собой собрание генов и последовательностей ДНК; в библиотеках кДНК представлены продукты экспрессии этих генов в форме мРНК.

А. Геномные библиотеки

Геномные библиотеки обычно создают с помощью векторов, сконструированных на основе бактериофага λ или космиды (рис. 6.32).

Геномная библиотека. Если геном какого-либо организма разрезать, вставить в плазмидные или вирусные вектора и ввести в клетку, то в таком виде его можно сохранить. При разрезании плазмидной или фаговой ДНК вероятность выпадения целых и неизмененных кусков генома довольно высока.

Такой способ получения геномной библиотеки получил название «метод дробовика», так как геном в данном случае представлен отдельными фрагментами.

Принципы создания плазмидных и вирусных векторов общие, поэтому рассмотрим их на примере плазмидных. Следует отметить, что из вирусных ДНК лучше использовать ДНК фагов, так как они имеют большую емкость и позволяют вставлять более крупные куски генома.
Очищенные кольцевые молекулы ДНК обрабатывают рестриктазой, получая линейную ДНК. Клеточную ДНК обрабатывают той же рестриктазой, добавляют к плазмидной, добавляют лигазы. Таким образом получают рекомбинантную плазмидную ДНК, которую вводят в бактериальные или дрожжевые клетки. Плазмида реплицируется с образованием многих копий. Многие плазмиды несут ген устойчивости к антибиотикам, и если в рекомбинантной плазмиде есть такой ген, то клетки легко выявлять, выращивая на среде с антибиотиком. Каждая такая колония представляет собой клон или потомство одной клетки. Плазмиды одной колонии содержат клон геномной ДНК, а совокупность плазмид можно назвать библиотекой геномной ДНК. Недостаток такого метода в том, что фрагменты ДНК образуются в огромном количестве. Разрезание геномной ДНК определяется случаем, поэтому лишь часть фрагментов содержат полноценные гены. Некоторые фрагменты могут содержать только часть гена или же интронные последовательности.

 

Эти векторы содержат большие вставки, благодаря чему минимизируется число рекомбинантов, необходимых для составления библиотеки. Фрагменты суммарной геномной ДНК для конструирования библиотек можно получать несколькими способами. Наиболее удобный из них состоит в частичном расщеплении ДНК рестриктирующей эндонуклеазой, сайт узнавания которой содержит шесть оснований (или более), а образующиеся липкие концы соответствуют липким концам выбранного вектора. В этом случае разрезание осуществляют лишь в ограниченном числе возможных сайтов. Поскольку выбор таких сайтов производится случайно и в используемом препарате геномной ДНК содержится много копий любого геномного сегмента, практически каждый сегмент ДНК должен быть представлен во фрагментах ДНК, пригодных по своему размеру для клонирования. При таком подходе, однако, может получиться неполная библиотека. Те части генома, в которых сайты узнавания рестриктирующих эндонуклеаз находятся слишком далеко друг от друга, не смогут включиться в жизнеспособный рекомбинантный фаг. С другой стороны, те области генома, в которых сайты узнавания тесно сгруппированы, будут разделены на очень короткие фрагменты, и не все из них будут представлены в библиотеке. Вообще говоря, более репрезентативную библиотеку можно получить при частичной фрагментации геномной ДНК, осуществляемой более случайно, чем с помощью фермента с сайтом узнавания из шести пар оснований. Для этого можно использовать гидродинамические методы деградации ДНК или очень ограниченную обработку эндонуклеазами с сайтами узнавания из четырех пар оснований, например Alu I и Наe III.

№10. Получение библиотек кДНК из отобранных популяций м РНК.

 

Геномные библиотеки представляют собой собрание генов и последовательностей ДНК; в библиотеках кДНК представлены продукты экспрессии этих генов в форме мРНК

Для создания библиотек кДНК обычно используют плазмидные или фаговые векторы, сконструированные на основе бактериофага λ. В этих случаях чаще используют смесь разных мРНК, а не очищенную мРНК. Полученные с помощью специально сконструированных векторов или определенным образом отобранные библиотеки кДНК могут использоваться для клонирования последовательностей мРНК даже в тех случаях, когда аминокислотная последовательность белка и кодирующая нуклеотидная последовательность неизвестны и даже отсутствует гомологичный зонд. Соответствующие примеры мы рассмотрим ниже.

Библиотека кДНК.

Создание кДНК начинается с синтеза на матрице РНК с помощью обратной транскриптазы комплементарной нити ДНК. Затем создают щелочные условия, разрушают цепь РНК на нуклеотиды, после чего с помощью ДНК-полимеразы синтезируют комплементарную цепь ДНК. При этом образуется фрагмент ДНК с тупыми концами. Такую ДНК встраивают в плазмиды и вводят в клетки бактерий. При амплификации плазмиды образуется клон комплементарной копии ДНК (кДНК).

Преимущества клоновой ДНК перед клонами геномной ДНК в том, что кодирующая белок нуклеотидная последовательность гена ничем не прерывается. Гены эукариот содержат интроны, которые должны удаляться из транскриптной РНК перед превращением ее в матричную, после чего следует сплайсинг. Бактериальные клетки не могут осуществлять такую модификацию РНК, образовавшуюся путем транскрипции гена эукариотической клетки. Поэтому если преследуют получение белка путем экспрессии клонированного гена, то лучше использовать банк кДНК, полученной на основе матричной РНК.

Библиотека экспрессирующихся кДНК. Очищенную кДНК или смесь разных кДНК можно лигировать с векторами, специально сконструированными для осуществления транскрипции и трансляции кодирующей области кДНК. Нужный клон идентифицируют с помощью иммунологического скрининга с применением антител, специфичных к полипептиду, кодируемому данной кДНК. Эта весьма удобная методика позволяет осуществить клонирование даже тогда, когда ничего не известно о структуре нужного нам гена или белка. Одним из векторов, широко применяемых для изучения экспрессии, является производное фага λ, получившее название λgt11.

Когда кДНК, содержащие EсоRI-линкеры, включаются в вектор λgt11 в его единственном сайте для эндонуклеазы EcoRI, вставки оказываются в области, кодирующей бактериальный ген β-галактозидазы (lacZ). Пример- но одна из шести кДНК-вставок включается в под ходящей для транскрипции ориентации и в фазе с рамкой считывания β-галактозидазы. (Копирование мРНК с образованием дуплексной кДНК редко происходит безошибочно, и лишь одна примерно из трех молекул кДНК начинает синтезироваться в правильном сайте.) При индукции β-галактозидазного гена с помощью β-галактозида в lac-промоторе начинается транскрипция, которая распространяется на эукариотический сегмент. В результате трансляции соответствующей РНК образуется гибридный белок, у которого на N-конце находится β-галактозидазный полипептид, а на С-конце – эукариотический.

Библиотека кДНК, созданная с помощью λgt11, образует популяцию бляшек, отдельные члены которой содержат эти гибридные белки. Бляшку, содержащую интересующий нас белок (и, следовательно, кДНК), идентифицируют по ее способности связывать соответствующее антитело. На одной чашке можно выявить одну позитивную бляшку среди 10 4 и без труда провести скрининг 10 6 бляшек.

Библиотеки селективных кДНК. Развитие и дифференцировка сложных многоклеточных организмов из одной оплодотворенной яйцеклетки осуществляются с помощью высокоорганизованной системы дифференцированной экспрессии генов. Одни гены экспрессируются только в одном или строго ограниченном числе типов клеток, другие – в какой- то определенный период времени. В результате популяции цитоплазматических мРНК в различных тканях и клетках оказываются представленными разными молекулами. Такая дифференцированная экспрессия генов может использоваться для клонирования кДНК, соответствующих регулируемым генам, даже в тех случаях, когда о продуктах этих генов ничего не известно. Например, при изучении процессов раннего развития Xenopus важно знать, какие гены экспрессируются при первых клеточных делениях. Для этого нужно идентифицировать те мРНК, которые присутствуют в гаструле, но не в яйцеклетках. Это можно сделать, создав геномную библиотеку и проведя раздельный скрининг с использованием препаратов РНК из яйцеклеток и гаструл. Затем можно идентифицировать и клонировать фаговые бляшки, которые дают положительный ответ при отжиге только с РНК гаструл. Однако данный метод имеет тот недостаток, что многие из 10 5 или более мРНК в двух указанных выше препаратах являются одинаковыми и приходится проводить скрининг громадного числа бляшек, чтобы обнаружить те немногие, которые проявляют специфичность. Более эффективным является создание библиотеки кДНК на основе гаструлярной РНК, кототая была предварительно обогащена последовательностями мРНК, специфичными для стадии гаструлы.

 

№11. Выявление нужных клонов в генной библиотеке путём гибридизации с радиоактивным ДНК зондом. Выделение перекрывающихся клонов ДНК («прогулка по хромосоме») с целью идентификации соседних генов.

Для выявления конкретных последовательностей нуклеотидов в клонотеках генов рекомбинантные бактерии или фаги рассеивают на чашках Петри и образовавшиеся колонии или бляшки переносят на нитроцеллюлозные или нейлоновые фильтры (до 10 000 бляшек с чашки диаметром 10 см). Для этого стерильные фильтры накладывают поверхность чашек, в результате чего часть бактериальных клеток или фаговых частиц прочно связывается с поверхностью фильтров. Расположение их на фильтрах точно совпадает с расположением их на поверхности чашек. Бактериальные клетки или фаговые частицы, сорбированные на фильтрах, лизируют щёлочью, что сопровождается одновременной денатурацией заключённой в них ДНК. Освободившуюся ДНК фиксируют на фильтрах и гибридизуют с меченным олигонуклеотидным зондом (зондом служат мРНК, ДНК или кДНК). Удобны одноцепочечные зонды, т. к. их не нужно денатурировать, последовательность нуклеотидов которого точно соответствует последовательности нуклеотидов искомой ДНК. (зонд – фрагмент ДНК, клонированный в плазмидном векторе и меченный путём ник-трансляции или другими методами ). В результате гибридизации происходит специфическое связывание зонда с идентичными или гомологичными последовательностями нуклеотидов в ДНК, содержащейся в отдельных бактериальных колониях или бляшках. После отмывки фильтров от не связавшегося радиоактивного зонда их высушивают и прикладывают к рентгеновской плёнке. Образование специфических гибридов обнаруживают после проявления рентгеновской плёнки по появлению на ней чётких гибридизационных сигналов в виде тёмных полос, положение которых точно соответствует положению определённых колоний на исходных чашках. Далее с помощью обычных микробиологических методов можно получать клонированную ДНК в неограниченном количестве.

Если исходная последовательность нуклеотидов не известна, но известна аминокислотная последовательность белка, то можно искусственно синтезировать ДНК, но из-за вырожденности генетического кода, последовательность нуклеотидов может не соответствовать истинной.

Прогулка по хромосоме.

Многие гены в геноме эукариот располагаются в виде кластеров, члены которых функционально или эволюционно связаны друг с другом. В связи с этим в молекулярной генетике часто возникает задача клонирования генов, расположенных по соседству с уже выделенными генами. Для ее решения был разработан метод «прогулки по хромосоме». Из клонотеки генов, полученной на основе фаговых или космидных векторов, выделяют ген и короткие 5'- и 3'- концевой фрагменты его последовательности используют в качестве зондов для поиска фрагментов ДНК, перекрывающихся с этим геном. Основным требованием, предъявляемым к зонду, является принадлежность его к уникальной последовательности нуклеотидов, т.е. встречающейся в геноме только один раз. С использованием такого подхода были исследованы многие кластеры эукариотических генов, в частности, бета-глобинового локуса человека, структура которого представлена на рис. II.14 .С помощью «прогулки по хромосоме» удается детально картировать участки ДНК длиной до 250 т.п.о.

 

GenBank.

База данных Национального центра биотехнологической информации (NCBI) - представляющей собой отдел Национальной медицинской библиотеки при национальном институте здоровья США. База содержит нуклеотидные последовательности. 602 072 354 п. о. в 920 588 последовательностях. База доступна пользователям сети Internet.

FASTA.

№16. Сайт-специфический мутагенез. Направленный мутагенезс помощью олигонуклеотидов. Мутагенез с ипспользованием ПЦР.

 

Мутагенез – это внесение изменений в нуклеотидную последовательность ДНК (мутаций). Сайт специфический (направленный мутагенез) – это внесение специфических изменений в кодирующие последовательности ДНК, приводящие к определённым изменениям в аминокислотных последовательностях. Если детально известна пространственная структура белка, то поиск нужной АК облегчается, однако для большинства белков такие данные отсутствуют. Поэтому направленный мутагенез основывается на методе проб и ошибок. Каждый белок, кодируемый мутантным геном нужно протестировать и убедиться в том, что мутация дала желаемый эффект. Для направленного мутагенеза клонированных генов используют разные экспериментальные подходы. В одних случаях вносят изменения в специфические сайты клонированного гена, в других случайным образом изменяют короткий фрагмент клонированного гена и среди образующихся мутантных белков выбирают один, обладающий необходимой активностью.

Олигонуклеотид направленный мутагенез – это один из наиболее простых методов внесения точковых мутаций в клонированный ген. Для его осуществления необходимо знать:

1. точную нуклеотидную последовательность области ДНК, которая соответствует мРНК кодону, подлежащему изменению.

2. характер аминокислотных замен.

Обычно встраивают ген-мишень в двухцепочечную форму вектора на основе б/ф M13.

Сначала выделяют одноцепочечную форму вектора ( +цепь М13) и смешивают её с синтетическим олигонуклеотидом, в точности комплементарным, (за исключением одного нуклеотида) нужному сегменту клонируемого гена. Этот отличающийся нуклеотид соотвествует тому нуклеотиду кодона мРНК, который необходимо изменить. Пример: триплет АТТ соответствующий изолейциновому кодону АУУ нужно заменить на ЦТТ, Который уже будет соответствовать ЦУУ.

Олигонуклеотид будет гибридизоватьсяс комплементарным участком клонированного гена, если:

1. он добавлен в количестве, во много раз превышающем количество ДНК М13

2. неспарившийся нуклеотид находится посередине олигонуклеотида.

3. отжиг проводят при низкой температуре и высокой ионной силе.

3'-конец олигонуклеотида – затравка. А ДНК М13 – матрица. Репликация осуществляется с помощью ДНК-полимеразы I при наличии в среде 4 дНТФ (дезоксрибонуклеозидтрифосфат), а присоединение последнего нуклеотида синтезированной цепи обеспечивается ДНК-лигазой фага Т4.

Мутантный ген вырезают и встраивают в какой-либо экспресирующийся вектор E.Coli. Мутантный белок экспрессируют и очищают.

Более простой и быстрый метод получения больших количеств мутантных генов, альтернативный системе с использованием фага М13, - сайт-специфический мутагенез в сочетании с ПЦР.

Один из вариантов: ген-мишень встраивают в плазмидный вектор и помещают в 2 пробирки. В каждую из них добавляют по 2 специальных праймера для ПЦР: 1 и 2 в одну пробирку, 3 и 4 в другую. Положение сайтов гибридизации праймеров 1 и 2 в одной пробирке и 3 и 4 в другой таково, что ПЦР-продукты в разных пробирках имеют разные концы. По окончании ПЦР содержимое пробирок объединяют и проводят денатурацию, а затем ренатурацию. Поскольку концы амплифицированных молекул ДНК из 2-х пробирок неодинаковы, одноцепочечные ДНК из разных пробирок ассоциируют с образованием кольцевых молекул с 2-мя одноцепочечными разрывами. Эти разрывы репарируются in vitro после трансформации E. Coli. При ренатурации одиночных цепей из одной пробирки образуются линейные молекулы.

 

 

№17. Амплификация ДНК с помощью ПЦР. Амплификация РНК с помощью ПЦР.

Амплификация – это любой процесс, увеличивающий числа копий какого-либо гена или последовательностей ДНК, гораздо выше обычного для организма уровня.

Амплификация является ключевым этапом ПЦР. Каждый цикл амплификации включает 3 этапа:

1. денатурация ДНК (при 93-95°С в течение 30-40 с.)

2. отжиг праймеров (присоединение праймеров). Праймер присоединяется комплементарно к соответствующей последовательности на границе специфического участка, выбранного для амплификации. Для каждой пары праймеров существует своя температура отжига, значения которой располагаются в интервале 50-65°С. Время 20-30 с.

3. Достраивание цепей ДНК. Происходит от 5´- к 3´-концу цепи в противоположных направлениях, начиная с участков присоединения праймеров.

Материалом для синтеза новых цепей ДНК служат добавленные в раствор дНТФ (дезоксирибонуклеозидтрифосфат). Процесс катализируется ферментом Taq-полимеразой. При 70-72°С. Время 20-40 с.

Для проведения амплификации небольшое кол-во рас-ра ДНК (3,5мкл) из клинического материала переносят в пробирку для ПЦР в которой содержится р-р праймеров под парафином «нижняя» ПЦР-смесь. Туда же добавляют «верхняя» ПЦР-смесь, состоящая из воды, ПЦР-буфера и р-ра дНТФ. Затем добавляют ДНК-полимеразу +1 каплю минерального масла для предотвращения испарения реакционной смеси. Пробу переносят в амплификатор. Время 1-3 ч.

Регистрация результатов:

Амплифицированный специфический фрагмент ДНК выявляют методом электрофореза в 2% агаровом геле в присутствии бромистого этидия. Бромистый этидий образует с фрагментами ДНК устойчивое соединение. Внедрение проявляют в виде светящихся полос при облучении геля с λ=290-330 нм.

Для определения наличия РНК-содержащих вирусов необходимо снять ДНК-копию РНК-вируса. Это проводят в реакции обратной транскрипции, с участием фермента ревертазы. В результате получается р-р содержащий ДНК-копию РНК- вируса (кДНК).

 

№18. Молекулярное клонирование ПЦР-продуктов.

Термостабильные ДНК-полимеразы, у которых отсутствует 3'-5'-экзонуклеазная активность, включают в оба конца продукта ПЦР независимо от матрицы 3'-выступающий остаток dA. Это обстоятельство препятствует непосредственному клонированию продуктов ПЦР по тупым концам линеаризованного вектора и требует предварительного удаления выступающих остатков с помощью ферментов, обладающих экзонуклеазной активностью
(S1), которые используют при проведении ПЦР в качестве добавок к основному полимеризующему ферменту. Несмотря на некоторое неудобство, доставляемое генным инженерам 3'-выступающими одноцепочечными нуклеотидами ПЦР-продуктов, это свойство ДНК-полимераз используется при создании плазмидных в

© 2013 wikipage.com.ua - Дякуємо за посилання на wikipage.com.ua | Контакти