PIR (Protein information Resource)

Фактографическая база данных. Образована в 1988 году. PIR содержит первичные структуры белков, опубликованные в литературе, предоставленные из нуклеотидных последовательностей, предоставленных GenBаnk, EML и другими базами данных. БД содержит информацию о названии белка и организма, из которого он был выделен, аминокислотную последовательность, основные характеристики белка и его функций в организме, а так же ссылки на литературу. БД доступна в Интернете. Версия базы №27 версия 7 620 688 п. о.

EMBL (European Molecular Biology Laboratory)

Наиболее распространённая фактографическая база данных. Основана в 1980 г. Содержит нуклеотидные последовательности из опубликованных статей, а так же непосредственно предоставленные авторами. В 1996 содержала 609 млн нт в 1 млн последовательностей. Доступна пользователям Internet.

FASTA.

№16. Сайт-специфический мутагенез. Направленный мутагенезс помощью олигонуклеотидов. Мутагенез с ипспользованием ПЦР.

Мутагенез – это внесение изменений в нуклеотидную последовательность ДНК (мутаций). Сайт специфический (направленный мутагенез) – это внесение специфических изменений в кодирующие последовательности ДНК, приводящие к определённым изменениям в аминокислотных последовательностях. Если детально известна пространственная структура белка, то поиск нужной АК облегчается, однако для большинства белков такие данные отсутствуют. Поэтому направленный мутагенез основывается на методе проб и ошибок. Каждый белок, кодируемый мутантным геном нужно протестировать и убедиться в том, что мутация дала желаемый эффект. Для направленного мутагенеза клонированных генов используют разные экспериментальные подходы. В одних случаях вносят изменения в специфические сайты клонированного гена, в других случайным образом изменяют короткий фрагмент клонированного гена и среди образующихся мутантных белков выбирают один, обладающий необходимой активностью.

Олигонуклеотид направленный мутагенез – это один из наиболее простых методов внесения точковых мутаций в клонированный ген. Для его осуществления необходимо знать:

1. точную нуклеотидную последовательность области ДНК, которая соответствует мРНК кодону, подлежащему изменению.

2. характер аминокислотных замен.

Обычно встраивают ген-мишень в двухцепочечную форму вектора на основе б/ф M13.

Сначала выделяют одноцепочечную форму вектора ( +цепь М13) и смешивают её с синтетическим олигонуклеотидом, в точности комплементарным, (за исключением одного нуклеотида) нужному сегменту клонируемого гена. Этот отличающийся нуклеотид соотвествует тому нуклеотиду кодона мРНК, который необходимо изменить. Пример: триплет АТТ соответствующий изолейциновому кодону АУУ нужно заменить на ЦТТ, Который уже будет соответствовать ЦУУ.

Олигонуклеотид будет гибридизоватьсяс комплементарным участком клонированного гена, если:

1. он добавлен в количестве, во много раз превышающем количество ДНК М13

2. неспарившийся нуклеотид находится посередине олигонуклеотида.

3. отжиг проводят при низкой температуре и высокой ионной силе.

3'-конец олигонуклеотида – затравка. А ДНК М13 – матрица. Репликация осуществляется с помощью ДНК-полимеразы I при наличии в среде 4 дНТФ (дезоксрибонуклеозидтрифосфат), а присоединение последнего нуклеотида синтезированной цепи обеспечивается ДНК-лигазой фага Т4.

Мутантный ген вырезают и встраивают в какой-либо экспресирующийся вектор E.Coli. Мутантный белок экспрессируют и очищают.

Более простой и быстрый метод получения больших количеств мутантных генов, альтернативный системе с использованием фага М13, - сайт-специфический мутагенез в сочетании с ПЦР.

Один из вариантов: ген-мишень встраивают в плазмидный вектор и помещают в 2 пробирки. В каждую из них добавляют по 2 специальных праймера для ПЦР: 1 и 2 в одну пробирку, 3 и 4 в другую. Положение сайтов гибридизации праймеров 1 и 2 в одной пробирке и 3 и 4 в другой таково, что ПЦР-продукты в разных пробирках имеют разные концы. По окончании ПЦР содержимое пробирок объединяют и проводят денатурацию, а затем ренатурацию. Поскольку концы амплифицированных молекул ДНК из 2-х пробирок неодинаковы, одноцепочечные ДНК из разных пробирок ассоциируют с образованием кольцевых молекул с 2-мя одноцепочечными разрывами. Эти разрывы репарируются in vitro после трансформации E. Coli. При ренатурации одиночных цепей из одной пробирки образуются линейные молекулы.

№17. Амплификация ДНК с помощью ПЦР. Амплификация РНК с помощью ПЦР.

Амплификация – это любой процесс, увеличивающий числа копий какого-либо гена или последовательностей ДНК, гораздо выше обычного для организма уровня.

Амплификация является ключевым этапом ПЦР. Каждый цикл амплификации включает 3 этапа:

1. денатурация ДНК (при 93-95°С в течение 30-40 с.)

2. отжиг праймеров (присоединение праймеров). Праймер присоединяется комплементарно к соответствующей последовательности на границе специфического участка, выбранного для амплификации. Для каждой пары праймеров существует своя температура отжига, значения которой располагаются в интервале 50-65°С. Время 20-30 с.

3. Достраивание цепей ДНК. Происходит от 5´- к 3´-концу цепи в противоположных направлениях, начиная с участков присоединения праймеров.

Материалом для синтеза новых цепей ДНК служат добавленные в раствор дНТФ (дезоксирибонуклеозидтрифосфат). Процесс катализируется ферментом Taq-полимеразой. При 70-72°С. Время 20-40 с.

Для проведения амплификации небольшое кол-во рас-ра ДНК (3,5мкл) из клинического материала переносят в пробирку для ПЦР в которой содержится р-р праймеров под парафином «нижняя» ПЦР-смесь. Туда же добавляют «верхняя» ПЦР-смесь, состоящая из воды, ПЦР-буфера и р-ра дНТФ. Затем добавляют ДНК-полимеразу +1 каплю минерального масла для предотвращения испарения реакционной смеси. Пробу переносят в амплификатор. Время 1-3 ч.

Регистрация результатов:

Амплифицированный специфический фрагмент ДНК выявляют методом электрофореза в 2% агаровом геле в присутствии бромистого этидия. Бромистый этидий образует с фрагментами ДНК устойчивое соединение. Внедрение проявляют в виде светящихся полос при облучении геля с λ=290-330 нм.

Для определения наличия РНК-содержащих вирусов необходимо снять ДНК-копию РНК-вируса. Это проводят в реакции обратной транскрипции, с участием фермента ревертазы. В результате получается р-р содержащий ДНК-копию РНК- вируса (кДНК).

№18. Молекулярное клонирование ПЦР-продуктов.

Термостабильные ДНК-полимеразы, у которых отсутствует 3'-5'-экзонуклеазная активность, включают в оба конца продукта ПЦР независимо от матрицы 3'-выступающий остаток dA. Это обстоятельство препятствует непосредственному клонированию продуктов ПЦР по тупым концам линеаризованного вектора и требует предварительного удаления выступающих остатков с помощью ферментов, обладающих экзонуклеазной активностью
(S1), которые используют при проведении ПЦР в качестве добавок к основному полимеризующему ферменту. Несмотря на некоторое неудобство, доставляемое генным инженерам 3'-выступающими одноцепочечными нуклеотидами ПЦР-продуктов, это свойство ДНК-полимераз используется при создании плазмидных векторов для непосредственного клонирования синтезированных продуктов ПЦР без предварительного "затупления" их концов. Такие векторы представляют собой линейные молекулы ДНК, у которых на концах имеются 3'-выступающие остатки dU, которые образуют комплементарные пары с 3'-выступающими остатками dA ПЦР-продуктов. Инкубация таких векторов с продуктами ПЦР в присутствии ДНК-лигазы при обычной температуре 6 °С в течение 0,5-2 ч сопровождается их эффективным лигированием. При этом для лигирования можно брать продукты ПЦР без предварительной очистки после экстракции реакционной смеси хлороформом для инактивации 7ад-ДНК-полимеразы.

В качестве примера вектора для непосредственного клонирования продуктов ПЦР можно упомянуть многофункциональный вектор pETBlue-1.

№19. Экспрессия белков в E.coli. Экспрессия белков с использованием Т7 РНК-полимеразы и промоторной системы.

Экспрессия гена – программируемый геномом процесс биосинтеза белков и (или) РНК. При синтезе белков Э. г. включает транскрипцию - синтез РНК с участием фермента РНК-полимеразы; трансляцию - синтез белка на матричной рибонуклеиновой кислоте, осуществляемый в рибосомах, и (часто) посттрансляционную модификацию белков.

Большое значение Э. г. имеет в оптимизации синтеза белков методами генетич. инженерии. В качестве продуцента используют бактерии, дрожжи, растительные и животные клетки и даже живые организмы, такие организмы называют трансгенными. Искусственные гены конструируются таким образом, чтобы получить макс. кол-во желаемого продукта с миним. затратами, другими словами, чтобы достичь максимально высокого уровня экспрессии активного белка. Для сильной экспрессии в искусственном, гене используют "сильные" регуляторные последовательности генов, обеспечивающие наибольшую продукцию белка. Часто эти последовательности ДНК имеют вирусное происхождение. Описаны случаи экспрессии целевого продукта в бактериях до уровня 50% от всего клеточного белка, Как правило, суперэкспрессированные белки нерастворимы и секретируются в переплазматическое пространство бактерии. Особую сложность представляет получение белков, токсичных для клетки. В таких случаях используют строго индуцибельные системы (напр., РНК-по-лимеразу фага Т7 и ген с промотором для нее) или системы, позволяющие быстро выводить продукт наружу (секретирующие системы). Тем не менее, достичь высокой продукции некоторых белков все же не удается.

Для эффективной экспрессии любого гена необходимо наличие сильного регулируемого промотора, расположенного перед данным геном. Такой промотор имеет высокое сродство к РНК-полимеразе, поэтому прилегающие к нему последовательности эффективно транскрибируются. Регулируемость промотора позволяет клетке осуществлять строгий контроль транскрипции.

Наиболее широко используются следующие промоторы: промоторы lac- и trp-оперонов E.coli, tac- промотор, левый, или p^L , промотор бактериофага λ, промотор гена 10 б\ф Е7. Для экспрессии клонированных генов широко используют промотор хорошо изученного lac-оперона. С каждым из них связывается соответствующие репрессоры, которые опосредуют включение и выключение транскрипции специфических генов. Для транскрипции с промотора б\ф Т7 нужна соответствующая РНК-полимераза. Чтобы можно было использовать этот промотор, ген РНК-полимеразы фага Т7 встраивают в хромосому E.coli в составе профага λ, поместив его под контроль lac- промотора. Затем клетки трансформируют плазмидой, содержащей ген-мишень под контролем Т7-промотора, и добавляют в среду ИПТГ (изопропил-β-D- тиогалактопиранозид), для включения лактозного оперона. В этих условиях происходит индукция гена РНК-полимеразы и происходят транскрипция и трансляция клонированного гена. Часто между временем индукции гена РНК-полимеразы Т7 и началом транскрипции гена-мишени проходит более часа. Для транскрипции с сильного Т7-промотора создана целая серия плазмид, получивших название pET- векторов.

№20. Экспрессия белков с использованием векторов с регулируемыми элементами фага λ. Продукция слитых белков с использованием специальных экспрессирующих векторов.

Векторы с промотором р_L, бактериофага λ.

Гибридные белки

Гибридные (химерные) белки представляют собой полипептидные цепи, искусственно составленные из фрагментов природных белков разного происхождения. Современные методы генной и белковой инженерии позволяют вводить в полипептидные цепи элементы вторичной структуры других белков, встраивать новые функциональные домены, заменять одни функциональные домены на другие, а также объединять целые белковые молекулы в одной полипептидной цепи. Из этого следует, что создание гибридных белков является одной из разновидностей рационального редизайна белковых молекул. Целью конструирования гибридных белков является улучшение свойств, имеющихся у исходных макромолекул, для более производительного их использования в биотехнологии, а также создание белков и ферментов с новыми свойствами. Работы в области гибридных белков, с одной стороны, направлены на изменение кинетических параметров ферментов, их субстратной специфичности, оптимума рН, термостабильности и других биотехнологических параметров. При другом подходе усилия исследователей сосредоточены на создании бифункциональных и многофункциональных белковых молекул, объединяющих в одной полипептидной цепи несколько функционирующих доменов.

№ 21.Системы экспрессии на основе бакуловирусов. Продукция больших количеств белков в клетках насекомых.

Вирионы бакуловирусов представляют собой палочковидные нуклеокаспиды, заключённые в липопротеиновую оболочку. Геном представлен двуцепочечной ДНК, размером до 160 тпн. Группа бакуловирусов подразделяется на субгруппы, 2 из которых формируют большие белковые кристаллы, куда упаковываются их вирионы. Данные кристаллы носят название – тела включения.

Субгруппа А – вирусы ядерного полиэдроза (NPV): образуют в ядре клетки полиэдры.

Субгруппа B – вирусы гранулёза(GV): в цитоплазме образуются кристаллические включенияв виде овальных гранул. В каждой грануле как правило 1 вирион.

Субгруппа С – не образуют тел включений.

Заражение происходит путём поедания белковых кристаллов насекомыми. Кристаллы растворяются в щелочной среде средней кишки, что провоцирует заражение. Первоначальные вирионы инфицируют клетки эпителия кишечника, где формируются свободные вирионы, которые затем, попав в гемолимфу, разносятся по тканям организма, где и формируют впоследствии тела включения.

Интерес вызывают механизмы, которые контролируют синтез большого количества полиэдрина или гранулина. ( 25% суммарного белка клетки). Такой синтез указывает на высокое содержание мРНК белков вируса в клетке. А такое количество мРНК говорит о силе промотора.

Регуляция экспрессии осуществляется по каскадному типу: предранние α-гены активируются факторами клетки-хозяина. Продукты α-генов активируют запаздывающие β-гены и некоторые поздние γ-гены. Экспрессия поздних генов связана с ситнезом вирусной ДНК. Очень поздние δ-гены обуславливают образование тел включения и экспрессируются тогда, когда репрессирована активность альфа-, бета- и гамма-генов.

Целевой ген встраивают внутрь фрагмента вирусной ДНК, клонированного в составе векторной плазмиды. В результате получают конструкцию, в которой целевой ген фланкирован последовательностями ДНК из определённого района вирусного генома. Котранфекцией в чувствительные клетки вводят нативную вирусную ДНК и гибридную плазмиду. В процессе рекомбинации по участкам гомологии происходит встройка целевого гена в выбранный участок вирусного генома.

Фенотипическим маркером для определения рекомбинантых вирусов является продукция полиэдрина. Путём вставки целевого гена в ген полиэдрина при участии ферметов S1, экзонуклеазы E. Coli III, ДНК-полимеразы Т4 и ДНК-лигазы.

№22. Системы для экспрессии белков в животных клетках. Векторы экспрессии на основе вирусов животных.

Из вопроса №7

№24.Электрофоретический анализ белков. Иммуноблотинг и иммунодетекция.

Электрофорез.

Используется агарозный гель и источник тока . В геле делаются лунки в которые вносится смесь белкового фрагмента в буфере с красителем. Через гель пропускают ток и фрагмент белка в зависимости от молекулярной массы движется в геле с определён скоростью. По расстоянию, которое прошёл белок в геле можно определить его молекулярную массу. При этом используется контрольная дорожка с заранее известной молек массой белковых фрагментов.

Иммуноблотинг– анализ смеси белков перенесённых на твёрдую подложку-мембрану, с которыми они связываются ковалентными связями, с последующей иммунодетекцией.

1.) Проводят белковый электрофорез.

2.) Переносят антигены (пептиды) на нитроцеллюлозный фильтр.

3.) Фильтр переносят в р-р содержащий антитела комплементарные похожему антителу. Образуется комплекс антиген-антитело. Не связавшиеся антитела отмываются.

4.) В р-р вносят мечный лиганд, способный связываться только с антителами. Образуется компелекс антитело-антиген-меченый лиганд.

5.) Фильтр отмывают от не связавшегося лиганда.

6.) Нитроцеллюлозный фильтр перемещается на фотопластинку и проводят экстрагирование (автрорадиография)

7.) Выявлят полосы соответствующие похожему антигену. Если использовать флюорисцентный лиганд, то определение по свечению при облучении светом определённой длины волны.

№25.Введение ДНК в клетки животных, растений, бактерий и дрожжей.

Прямой метод введения трансгена в растения.

На первых этапах развития rенетической инженерии растений возникали большие сложности в осуществлении аrробактериальной трансформации различных видов растений, и в первую очередь однодольных. Поэтому бы­ли предприняты попытки найти более универсальный метод введения молекул ДНК в клетки растений. В 1987 r. Дж, Сэнфорд с соавторами разработали метод бомбардирования микрочастицами и опробовали eгo на тканях лука. В качестве мишени был использован монослой больших эпидермальных клеток. Затем этот мe­тодический прием был успешно реализован на многих видах растений, а также на бактериях, гpибах и даже животных.

Современные варианты приборов для бомбардирования микрочас­тицами называют обычно генными пушками. Для бомбардирования наиболее удобны хи­мически инертные частицы золота диаметром O,­3 мкм, на которые адсорбируют молекулы ДНК. Этими частицами заряжают генную пушку, и после выстрела частицы пробивают клеточные стенки, ДНК попадает внутрь клетки и в конечном итоге ­ в ядро (или пластиды). Для многих исследований можно использовать более дешевый «носитель» ДНК ­- вольфрамо­вые микрочастицы, однако иногда они проявля­ют фитотоксичность. Вводимые методом бомбардирования плаз­миды обычно содержат гены, необходимые для размножения и селекции гибридных плазмид в бактериальных клетках, а также селективный и целевой гены, находящиеся под контролем промоторов и терминаторов транскрипции, функционирующих в растениях. В качестве ceлективного для трансформированных растений гeнa чаще вceгo используют ген устойчивости к канамицину. Уже через час после бомбардирования в тканях растения может быть выявлена экспрессия вводимого тpaнcгeнa, однако стабильная интеrрация плазмидной ДНК наблюдается лишь в нeбольшой доле клеток, в которые она была ввeдена. Это указывает на то, что большая часть плазмид в клетке дегpадируется. В клетке плазмидные ДНК рекомбинируют между собой и хромосомной ДНК в результате плазмида может интеrpироваться в хромосомную ДНК растения в индивидуальном или, ча­ще, в мультимерном виде. Встройка в хромосомную ДНК растений происходит случайным образом, как и в клетках млекопитающих. Meтод бомбардирования позволяет осуществлять котрансформацию растений разными плазми­дами, при этом плазмиды обычно встраиваются в геном растения как коинтеrpанты. На основa­нии полученных результатов можно полагать, что механизм интеrpации чужеродной ДНК в хромосомы клетки при прямом переносе плаз­мид, не содержащих протяженных областей гoмологии с хромосомной ДНК схож у растений, животных и дрожжей.

Подавляющее большинство вирусов pacтe­ний являются вирусами с одноцепочечной РНК и реплицируются в цитоплазме клетки. Вирусы в растениях накапливаются до высоких концeнтраций, поэтому заманчиво использовать их в качестве многокопийных экспрессирующих векторов. При этом генно­инженерные манипу­ляции по встройке целевых последовательно­стей в вирусный геном осуществляют на клонированных в бактериальных плазмидах ДНK ­копиях вирусных РНК. ДНК­копию в плазмиде встраивают между промотором и терминатором транскрипции фаrа (например Т7). с помощью фаrовой РНК­полимеразы in vitro синтезируют РНК­транскрипты rибридных ДНК и трансфицируют ими протопласты или ткани растения.

Введение молекул ДНК в клетки бактерий

Необходимый этап rенно­инженерноrо эксперимента ­ введение полученных in vitro rибридных молекул ДНК в пермиссивные клетки(обеспечивающие репликацию этих молекул) с целью размножения, селекции и выделения клонов rибридов. Введение в клетку нуклеиновой кислоты ви­руса с последующим образованием вирусноrо потомства называется трансфекцией, Эффек­тивность трансфекции выражается обычно ко­личеством инфекционных центров (бляшек, He­rативных колоний), приходящихся на молекулу или на единицу массы нуклеиновой кислоты вируса. Вирусные клоны, полученные после трансфекции из отдельных бляшек, называют трансфектантами.

Введение молекул ДНК в клетки растений.

В 1982 r. Т, Bонг и Е, Нейман с сотрудниками для введения молекул ДНК в культивируемые клетки мыши применили метод, получивший название электропорация. В последующие roды метод был усовершенствован, что позволило использовать ero эффективно как для эукариотических, так и для прокариотических клеток, Суть данноro подхода состоит в том, что кратковременное воздействие (обычно 5­20 мс) электрическоrо поля высокой напряженности (1­15 кВ/см) на клеточную мембрану приводит к образованию в ней пор (электропро­бой), Время существования и размер пор достaточны, чтобы такие макромолекулы, как ДНК, моrли из внешней среды войти в клетку в peзультате действия осмотических сил. Объем клетки при этом увеличивается. Напряженность электрическоrо поля и продолжительность ero действия, концентрации трансформирующей ДНК и клеток-­реципиентов для каждой систе­мы клеток подбирают экспериментально, с тем чтобы добиться высокой частоты поrлощения ДНК выжившими клетками, Показано, что в оптимальных условиях электропорации количест­во трансформантов может достиrать 80 % выживших клеток. Электропорация ­ физический, а не хими­ческий метод, и это, по­видимому, обусловливает ero широкое применение. Электропорация может успешно использоваться для введения молекул ДНК в разные типы клеток, такие как культивируемые клетки животных, простей­шие, дрожжи, бактерии и протопласты pacтeний. Для эффективноro поrлощения ДНК мелким бактериальным клеткам требуется значительно большая напряженность электрическоrо поля (1 О кВ/см и более), чем крупным животным и растительным клеткам (l­2 кВ/см), Электропорация ­ наиболее простой, эффективный и воспроизводимый метод ввeдeния молекул ДНК в клетки.

№ 26. Конструирование линий клеток, суперпродуцирующих биологически активные вещества.

В качестве реципиентных клеток-продуцентов, в которые вводятся генетические конструкции, обычно используют микроорганизмы, в частности, бактерии, поскольку они обеспечивают максимальную биопродукцию за короткий промежуток времени, не так требовательны к составу культуральной среды и условиям культивирования, как эукариотические клетки. Наиболее часто используют E.coli, в первую очередь, из-за её хорошей изученности в генетическом и биохимическом плане.

В случае, если ген, продукт которого должен суперпродуцироваться, находится в составе генома прокариотического организма, задача упрощается, ибо гены эукариот имеют прерывистое строение, и для их клонирования необходимо сначала получить кДНК на матрице зрелой мРНК при помощи обратной транскриптазы.

При клонировании и экспрессии эукариотических генов необходимо учитывать трудности, с которыми, возможно, придётся столкнуться: различия в системах транскрипции и трансляции у про- и эукариот (что может значительно влиять на эффективность), способность стабильного поддержания клонированного гена в реципиентной клетке, способность процессирования продукта трансляции, наличие слабых внутригенных терминаторов и т.д.

Следует отметить, что гибридные гены, у которых кодирующая последовательность представлена кДНК, а сигналы инициации транскрипции и трансляции имеют бактериальное происхождение, уже способны достаточно эффективно экспрессироваться.

В случае, если целевой продукт – белок, создание линий сверхпродуцентов сводится к подбору более мощных бактериальных или фаговых промоторов, например, промотора tac (lac + trp-промоторы – гибрид), устранению слабых внутригенных терминаторов, при необходимости – вставка rbs-сайта в позиции, в которой обеспечивается наиболее эффективная посадка прокариотических рибосом, введение энхансерных областей.

В случае регуляции транскрипции (это относится к оперонам прокариот!) по механизму индукции (т.е. сам процесс транскрипции находится под негативным контролем, как у lac-оперона) можно использовать индуцированный сайт-специфический мутагенез для внесения мутаций, нарушающих функциональную активность генов, детерминирующих специфический белок-репрессор, вследствие чего можно получить конститутивный мутант, продуцирующий целевой продукт в больших количествах.

Вообще, создание суперпродуцентов часто основано на изменении регуляторных систем экспрессии.

Например, в случае синтеза небелковых соединений в этом процессе участвует большое число ферментов биосинтетического пути. Для такого типа синтеза характерна регуляция по типу ретроингибирования, поэтому используют клетки мутантных штаммов, опред. Фермент которых является частично дефектным и не способен связываться с конечным продуктом биосинтетического пути (вследствие изменения структуры аллостерического центра) при сохранении ферментативной активности.

Также могут использоваться термочувствительные мутанты.

Общая схема вектора, который может использоваться для создания суперпродуцентов:pBR322 + tac-промотор (или другой сильный промотор), расположенный перед полилинкером, rbs-сайт для прокариотических рибосом в оптимальном положении + инактивация гена, детерминирующего специфич. белок-репрессор, при помощи сайт-специфического мутагенеза.

№ 27. Технология получения трансгенных растений и цели и задачи, решаемые с помощью данной технологии.

Для переноса чужеродных генов в растительные клетки используется 3 основных метода:

1) с помощью векторов на основе Ti-плазмид Agrobacterium tumefaciens;

2) с помощью вирусов;

3) с использованием трансгенной системы хлоропластов.

На основе Ti-плазмид.

При инфицировании A.tumefaciens в растительные клетки попадает лишь участок Ti-плазмиды, называемый Т-ДНК, который несёт гены, детерминирующие синтез опухолегенных фитогормонов, а по обе стороны фланкирован несовершенными прямыми повторами, называемыми RB и LB, причём RB (правый фланкирующий повтор) играет решающую роль при переносе Т-ДНК в растительную клетку. Гены же, расположенные между этими повторами, несущественны для переноса, поэтому в эту область можно встраивать чужеродную ДНК, кодирующую целевой продукт (размер Т-ДНК – 10-30 т.п.н.).

Было обнаружено, что эффективный перенос Т-ДНК происходит и в том случае, если Т-ДНК и гены, обеспечивающие вирулентность (vir-гены), находятся в разных репликонах (транс-положение). На основе этого была создана бинарная векторная система.

Её компоненты: бинарный вектор (плазмида, содержащая Т-ДНК) и хелпер (плазмида, несущая гены vir). Хелперная плазмида – это та же Ti-плазмида, но с делецией всей Т-ДНК или её части, такую плазмиду называют обезоруженной. В Т-ДНК бинарного вектора встраивают также маркерный ген (ближе к LB), например, ген устойчивости к канамицину, что позволяет проводить отбор рекомбинантных растительных клеток.

Само трансгенное растение выращивают либо из каллусной культуры, клетки которой несут рекомбинантную Т-ДНК, либо рекомбинантный штамм A.tumefaciens наносят на поверхность раневых повреждений (срезов) проростков растения.

На основе вирусов

Вирусы растений в подавляющем большинстве содержат в качестве генома одноцепочечную РНК, поэтому сначала получают кДНК, и после встраивания в неё чужеродных генов на её матрице синтезируют рекомбинантную геномную РНК. Наиболее часто используют вирус табачной мозаики (VTM), особенно для иммунизации животных и человека. Чужеродный ген, кодирующий определённый антиген белковой природы, встраивают вблизи или непосредственно в ген, кодирующий белок субъединиц капсида, так, чтобы получился их продукт – химерный белок, формирующий субъединицы капсида, несущие на внешней поверхности белок-антиген. Препараты на основе таких вирусов используют для иммунизации животных (как вакцину).