ВІКІСТОРІНКА
Навигация:
Інформатика
Історія
Автоматизація
Адміністрування
Антропологія
Архітектура
Біологія
Будівництво
Бухгалтерія
Військова наука
Виробництво
Географія
Геологія
Господарство
Демографія
Екологія
Економіка
Електроніка
Енергетика
Журналістика
Кінематографія
Комп'ютеризація
Креслення
Кулінарія
Культура
Культура
Лінгвістика
Література
Лексикологія
Логіка
Маркетинг
Математика
Медицина
Менеджмент
Металургія
Метрологія
Мистецтво
Музика
Наукознавство
Освіта
Охорона Праці
Підприємництво
Педагогіка
Поліграфія
Право
Приладобудування
Програмування
Психологія
Радіозв'язок
Релігія
Риторика
Соціологія
Спорт
Стандартизація
Статистика
Технології
Торгівля
Транспорт
Фізіологія
Фізика
Філософія
Фінанси
Фармакологія


Двухеибридная система дрожжей для идентификации белок-белковых взаимодействий

Взаимодействия между двумя белками чаще вcero выявляют in vitro, используя биохимические процедуры, такие как кофракционирование при хроматоrpафии, коиммунопреципита­ция или химическое сшивание белков.

С. Филдс и О. COHr в 1989 r. описали принципиально новую экспериментальную систему для выявления взаимодействия белков в эукриотической системе in vivo, использующую особенности орrанизации и функционирования белка GAL4 дрожжей S. caevisiae. Этот белок является активатором транскрипции reHoB, KOдирующих ферменты метаболизма rалактозы. GAL4 состоит из двух доменов: N­KoHueBoro домена, который связывается со специфически­ми последовательностями ДНК ­ UASG , а также с ­концевоrо домена, содержащеrо последовательности, необходимые для активации транскрипции. Данные домены называют соответственно ДНК­связывающим (GAL4­BD) и активаторным (GAL4­AD). OKa­залось, что домень.. белка GAL4 MorYT выпол­нять свою интеrpальную функцию и в том случае, Korдa они входят в состав двух разных хи­мерных белков, которые in vivo взаимодействуют между собой.

Дрожжевая двухrибридная система нашла широкое применение для изучения взаимодействия белков различных орrанизмов и вирусов, Первый анализ белок­-белковых взаимодейст­вий на уровне полноro генoмa был осуществлен rpуппой С, Фющса в 1996 r, на примере фаrа Т7, reHoM этоro фаrа имеет размер 39 937 пн и кодирует 55 потенциальных ОРТ, В системе Е, соН были получены наборы плазмид pOBD и pOAD (рис. 12.36), содержащих статистиче­ски встроенные фрarменты ДНК фаrа Т7, полученные в результате обработки фаroвой ДНК ультразвуком (озвучивания). rибридные плаз­миды затем переносили в клетки rаплоидных штаммов дрожжей с разным типом спаривания, раздельно для каждоro набора плазмид, После спаривания клеток из полученных rибридных клонов отбирали диплоидные варианты, coдep­жащие обе плазмиды, и проверяли их на нали­чие активности Р­rалактозидазы (белок­-6елковoro взаимодействия). Пары плазмид, для которых обнаруживали взаимодействие слитых бел­ков, секвенировали в районе встройки фаrовой ДНК В результате этой работы для фаrа Т7 были выявлены 25 белок­-белковых взаимодей­ствий.

 

№39. Технология получения животных с полезными свойствами, цели и задачи, решаемые с помощью данной технологии.

Разработка системы генетической тpaнс­формации культивируемых клеток млекопи­тающих позволила подойти к решению тaкoгo важного вопроса, как введение чужеродных гe­нов в орrанизм животных и получение линий животных, передающих по наследству приоб­ретенные гeны . Таких животных принято называть трансгенными животными.

Внедрение чужеродной ДНК можно осуществить разными методами:

1.с помощью ретровирусных векторов, инфицирующих клетки эмбриона на ранних стадиях развития перед имплантацией эмбриона в самку-рецепиента.

2.микроинъекцией в увеличенное ядро спермия (мужской пронуклеус) оплодотворенной яйцеклетки.

3.введением генетически модифицированных эмбриональных стволовых клеток в предимплантированный эмбрион на ранних стадиях развития.

Мuкроuнъекцuя ооцитов

В 1982 г. показано, что чужеродные эука­риотические гeны, введенные микроинъекцией в ооциты Xeпopus laevis или культивируемые клетки животных, способны экспрессироваться в гeтерологичном окружении. При этом чуже­родная ДНК может интегpироваться в гeнoм клетки. Полученные результаты указывали на то, что микроинъекция молекул ДНК в оплодо­творенные ооциты животных может оказаться перспективным методом введения чужеродных гeнoв в организм животных. Точный механизм, обеспечивающий инте­гpацию инъецированной ДНК в хромосомы клетки­-хозяина, неизвестен, однако некоторое представление о характере процесс а можно co­ставить на основе анализа структурной органи­зации ДНК, интегpированной в гeнoм тpaнcгe­нных мышей. Примерно у 70 % трансгенных мышей во всех соматических клетках и клетках за­родышевоro пути имеется экзогенная ДНК, что свидетельствует о том, что интегpация обычно происходит до первоrо цикла репликации ДНК Остальные 30 % трансгенных животных обна­руживают ту или иную степень мозаичности, что, вероятно, является следствием интегpации ДНК на более поздних стадиях.

Эмбриональные стволовые клетки

При создании трансгенных животных ис­пользуют также плюрипотентные эмбриональ­ные стволовые клетки (ЕS­-клетки), взятые из бластоцисты, ЕS­-клетки можно культивировать in vitro и после необходимых манипуляций вep­нуть в орrанизм, инъецируя их в бластоцисту.

­Клетки колонизируют эмбрион и участвуют в eгo нормальном развитии, давая начало клет­кам всех типов соматических тканей и нередко клеткам зародышевоrо пути. Прежде чем инъе­цировать ЕS­-клетки в бластоцисту, в них вводят целевые трансгены ­ либо путем трансфек­ции, либо инфицируя их рекомбинантными peтровирусами.

Ретровирусы

Инфицирование предимплантированных эмбрионов рекомбинантными ретровирусами ­ относительно несложная процедура, не требую­ щая дороrостоящеrо оборудования. Эмбрионы инфицируют следующим образом: восьмикле­точную МОРУЛУ освобождают от яйцевой оболочки и помещают в культураль­ную чашку с фибробластами, продуцирующи­ми рекомбинантный ретровирус. После инфи­цирования эмбрионы, достигшие стадии блас­ тоцисты, вводят в матку псевдобеременной самки; часть эмбрионов продолжает нормально развиваться и в положенный срок превращается в трансгенных детенышей. В результате использования данной схемы часто формируется организм, мозаичный по чис­лу и локализации вирусных встроек в клетках. Поэтому для получения чистых линий, пригодных для исследования экспрессии введенных re­нов, необходим масштабный аутбридинг.

БИОТЕХНОЛОГИЧЕСКОЕ ПРИМЕНЕНИЕ TPAHCГEHHЫX ЖИВОТНЫХ

В 1988 г. впервые удалось получить тpaнсгенных овец, продуцирующих с молоком фак­тор свертывания крови, необходимый для лече­ния людей, больных rемофилией. В последую­щие rоды в мире было создано около 20 типов трансгенныx коров, коз, свиней, овец и кроли­ков, которые продуцировали такие ценнейшие фармацевтические вещества, как тканевой aктиватор плазминогена, различные монокло­нальныe антитела, эритропоэтин, инсулинопо­добный фактор роста, интерлейкины, анти­трипсин и др. Работы в этом направлении про­должаются, и спектр лекарственныx веществ, полученных с помощью трансгенных сельско­хозяйственных животных, расширяется. Oднa­ко, традиционная технология создания тpaнсгенныx животныx путем микроинъекции гeн­ных конструкций в пронуклеус зиготы является очень трудоемкой и малоэффективной, и это cy­щественно тормозит внедрение новых разрабо­ток в практику промышленного производства.

Исследования на трансгенных мышах способствовали установлению механизмов генной регуляции и развития опухолей, природы иммунологической специфичности, молекулярной генетики роста и развития. Трансгенные мыши сыграли свою роль в исследовании возможности крупномасштабного синтеза лекарственных веществ, а также в создании трансгенных линий, позволяющих моделировать различные генетические болезни человека.

 

 

№40. Векторы и приёмы, используемые в генотерапии.

В самом общем смысле под генной терапией соматических клеток человека понимают коррекцию специфического наследственного заболевания путем введения в клетку-мишень функционального экспрессирующегося гена. Конечной целью медико-генетических исследований является создание методов лечения всех наследственных заболевании. Появляются все новые подходы к генной терапии соматических клеток, которые можно разделить ex vivo и in vivo.

Генная терапия ex vivo.

Генная терапия ex vivo, как правило, включает следующие этапы

1. Получение клеток от больного.

2. Исправление генетического дефекта с помощью переноса нужного гена в изолированные клетки.

3. Отбор и наращивание генетически «исправленных» клеток.

4. Инфузия или трансплантация этих клеток пациенту.

Использование собственных клеток пациента (аутологичных клеток) гарантирует, что после инфузии или трансплантации у него не разовьется иммунный ответ.

Необходимо, чтобы процедура переноса генов, используемая для генной терапии ex vivo,была эффективной, а «терапевтический» ген стабильно поддерживался и непрерывно экспрессировался. Этим условиям отвечают векторы, полученные на основе мышиных ретровирусов. Но ретровирусы имеют существенный недостаток — они могут приводить к злокачественной транформации клеток. Такую вероятность необходимо уменьшить, а лучше полностью исключить.

Для получения ретровирусного вектора полноразмерную ДНК ретровируса встраивают в плазмиду, с помощью эндонуклеазного расщепления удаляют большую часть гена gag и гены pol и env, оставляя 5'-концевой участок гена gag и 5'- и 3’-LTR, а затем рядом с ψ+-областью встраивают «терапевтический» ген, транскрипция которого будет контролироваться 5'-LTR-промотором; при необходимости можно встроить и маркерный селективный ген с собственным промотором. Такая конструкция позволяет экспрессировать оба клонированных гена. На основе этой схемы созданы различные ретровирусные векторы. Максимальный размер ДНК-вставки, которую может переносить ретровирусный вектор, — примерно 8 т. п. н.

ДНК ретровирусного вектора можно использовать для трансформации клеток саму по себе, но эффективность доставки ее в ядро и интеграции в геном клетки-хозяина крайне низка. Поэтому была разработана методика упаковки полноразмерной РНК ретровирусного вектора в интактные вирусные частицы, с высокой частотой проникающие в клетку, что гарантирует встраивание соответствующей ей ДНК в геном клетки -хозяина. Для этого с помощью генной инженерии была создана «пакующая» клеточная линия, в одном из участков генома которой содержится ∆ψ+-сегмент 5'-LTR-gag-3'-LTR (т. е. сегмент, лишенный функциональной ψ+-последовательности), а в другом — ∆ψ+-сегмент 5'-LTR-pol-env-3'-LTR. Оба этих сегмента транскрибируются, но из-за отсутствия ψ+-последовательности и образования вирусных молекул РНК меньшего, чем в норме, размера формируются пустые вирусные частицы. При трансфекиии ДНК ретровирусного вектора в такие клетки она встраивается в хромосомную ДНК и транскрибируется с образованием полноразмерной РНК ретровируса, содержащей ψ+-последовательность. В таких условиях в вирусные капсиды упаковывается только РНК вектора. Образующиеся интактные вирусные частицы можно использовать для высокоэффективной доставки ретровирусного вектора в клетки-мишени.

В «пакующей» клеточной линии не образуются компетентные по репликации ретровирусы дикого типа, способные встраиваться в гены и приводить к некотролируемой пролиферации некоторых клеток (т. е. к превращению их в раковые клетки). Это весьма существенно, особенно если частицы ретровирусного вектора предполагается использовать для генной терапии соматических клеток человека. В качестве меры предосторожности все же проводят регулярное тестирование готовых ретровирусных векторов, с тем чтобы выявить ретровирусы дикого типа. Кроме того, в «пакующей" клеточной линии нуклеотидные последовательности ретровируса и вектора локализованы в трех разных областях хромосомы, что делает весьма маловероятной возможность последовательных рекомбинационных событий, которые могли бы привести к образованию компетентного по репликации ретровируса.

Генная терапия in vivo.

Генная терапия in vivo предполагает доставку «терапевтического» гена непосредственно в клетки определенной ткани пациента. Ретровирусные векторы проникают только в делящиеся клетки-мишени, однако во многих тканях, на которые направлена генная терапия, большинство клеток не делится. Поэтому были разработаны разнообразные вирусные и невирусные векторные системы доставки «терапевтических» генов, учитывающие большое число потенциальных тканей-мишеней (кожа, мышцы, легкие, мозг, толстая кишка, селезенка, печень, клетки крови) и расположение их в организме человека. «Идеальная» система доставки должна обеспечивать высокую эффективность поглощения «терапевтического» гена клетками-мишенями, минимальность его внутриклеточного разрушения при транспорте в ядро и поддержание уровня экспрессии, достаточного для облегчения состояния больного.

Векторы используемые в генотерапии:

Ретровирусные векторы

Опыт клинических испытаний с участием более 200 пациентов показывает, что дефектные по репликации ретровирусные векторы не оказывают каких-либо неблагоприятных побочных эффектов. Тем не менее безопасности их применения продолжают придавать большое значение. Создана конструкция, называемая плазмовирусом, которая содержит ретровирусные гены gag и pol, находящиеся под контролем 5'-LTR-промотора, a также «терапевтический» ген и ген env, управляемые цитомегаловирусным промотором. После трансфекции плазмовирус запускает образование дефектных по репликации вирусных частиц, причем вероятность рекомбинации с образованием компетентных по репликации ретровирусов очень мала. Вектор может переносить не более 3,5 т. п. и. ДНК, но и длина большинства потенциальных «терапевтических» кДНК и генов — супрессоров опухолей составляет 0,5—2 т. п. н. Ретровирусы активно инфицируют реплицирующиеся клетки. Для переноса генов в интенсивно растущие клетки-мишени последние обрабатывают очищенными частицами упакованного ретровирусного вектора либо проводят их совместное культивирование с производящей его клеточной линией, а затем осуществляют дифференциальную селекцию для разделения клеток-мишеней и «пакующих» клеток. Трансдуцированные клетки-мишени (те, в которые при помощи вируса была перенесена невирусная ДНК) тестируют, чтобы удостовериться, что: I ) в них синтезируется продукт терапевтического гена; 2) не образуются компетентные по репликации ретровирусы; 3) ДНК ретровирусного вектора не встроилась в сайт, изменяющий способность клеток к росту либо препятствующий их нормальному функционированию. После тестирования трансдуцированные клетки наращивают в больших количествах и с разными интервалами вводят пациенту

Аденовирусные векторы

Аденовирусы инфицируют неделящиеся клетки человека и широко используются в качестве живых вакцин, которые предотвращают респираторные инфекции и гастроэнтериты, не оказывая побочного действия. Эти свойства делают аденовирусы перспективными для доставки генов в клетки-мишени.

Для получения аденовирусного вектора провели котрансфекцию клеточной линии, синтезирующей продукты аденовирусного гена El, двумя участками генома аденовируса . Один из них может существовать в виде плазмиды в Е. coli и содержит вместо E1-области «терапевтический" ген, фланкируемый нуклеотидными последовательностями аденовируса, а второй представляет собой молекулу ДНК аденовируса, которая лишена 5'-концевого участка, включающего El-область, и имеет перекрывающийся участок с несущей терапевтический ген плазмидой. Рекомбинация между двумя трансфицирующими фрагментами ДНК в области их перекрывания приводит к восстановлению полноразмерного аденовирусного гена, в котором вместо E1-области находится терапевтический ген. Продукты гена E1, поставляемые клеткой-хозяином, инициируют образование вирусных частиц, высвобождающихся из клетки в результате лизиса. Клонирующая емкость аденовирусного вектора составляет около 7,5 т. п. н.

После того как рекомбинантный аденовирус инфицирует клетку-мишень, его ДНК проникает в ядро, где и происходит экспрессия «терапевтического» гена. Рекомбинантная ДНК не интегрирует в хромосому и сохраняется непродолжительное время, поэтому при проведении генотерапии с использованием аденовирусных векторов необходимо вводить их с определенной периодичностью.

Аденовирусные векторы использовали в клинических испытаниях по генной терапии муковисцидоза

 

Векторы на основе аденоассоциированных вирусов

Аденоассоциированные вирусы (ААВ) — это небольшие непатогенные вирусы человека с одноцепочечным ДНК-геномом (4,7 т. n. H.), который может интегрировать в специфический сайт 19-й хромосомы. Такое название они получили потому, что для продуктивной инфекции им необходимы белки другого вируса (вируса-помощника), например аденовируса. После того как ААВ попадает в ядро, его геном с помощью полимераз клетки-хозяина преобразуется в двухцепочечную ДНК и транскрибируется.

Отсутствие патогенности делает ААВ весьма перспективным вектором для доставки в организм человека «терапевтических» генов. Рекомбинантный ААВ получают с помощью котранс-фекции клетки-хозяина, инфицированной каким-нибудь аденовирусом (вирусом-помощником), двумя плазмидами (рис, 21.8). Одна из них несет «терапевтический» ген, фланкированный инвертированными концевыми повторами (длиной от 125 п. н.) ААВ, а вторая — два его гена, rep и cap, ответственные за репликацию генома и синтез капсида соответственно. После лизиса инфицированных клеток рекомбинантные ААВ отделяют от аденовируса с помощью центрифугирования и диализа, а оставшиеся в образце аденовирусы (вирусы герпеса) инактивируют нагреванием. Рекомбинантный ААВ может нести ДНК-вставку размером до 4,5 т. п. н., не вызывает развития иммунного ответа, поскольку не содержит ААВ-генов, но и не может интегрировать в 19-ю хромосому из-за отсутствия гена rep.

 

 

№41. Фаг М13.Фаговый дисплей.

Метод фагового дисплея, разработанный Г.П. Смитом в 1985 г., представляет собой простую и эффективную систему отбора белков и пептидов с требуемыми свойствами, экспрессированных на поверхности частиц нитевидных бактериофагов.

Возможность эффективного использования фагового дисплея для проведения направленной эволюции белковых молекул определяется наличием в системе прямой связи между аминокислотной последовательностью исследуемого белка и кодирующей ее последовательностью нуклеотидов генома бактериофага, т.е. между генотипом фаговой частицы и ее фенотипом. Это достигается клонированием целевой нуклеотидной последовательности в составе гибридной последовательности, которая, кроме нее, включает ген одного из белков фаговой оболочки. Во время фаговой инфекции в результате экспрессии гибридного гена происходит образование химерного белка, который встраивается в оболочку бактериофага, а исследуемая полипептидная цепь экспонируется наружу фаговой частицы и может быть изучена на предмет наличия у нее определенных свойств. Использование при клонировании различных (например, измененных под действием мутаций) нуклеотидных последовательностей приводит к созданию клонотеки таких последовательностей в составе фаговых частиц и одновременно клонотеки полипептидов, в которой каждый гибридный полипептид не теряет связи с кодирующим его геном. Это дает возможность при необходимости продолжать работу с такой искусственной генетической системой, как на генном уровне, так и с самим очищенным белком, после заражения бактериальных клеток отдельной фаговой частицей и очистки бактериофага. Процедура отбора требуемой фаговой частицы из клонотеки проста. В том случае, если ведется отбор на способность гибридного белка взаимодействовать с конкретным иммобилизованным лигандом, после инкубации суспензии фаговых частиц с сорбентом несвязавшиеся частицы отмывают, а оставшиеся в комплексе с лигандом бактериофаги после элюирования используют для заражения бактериальных клеток. Амплифицированные таким образом гибридные гены являются исходным материалом в новом раунде мутагенеза и селекции.

При конструировании клонотек нуклеотидных последовательностей для фагового дисплея чаще всего используют хромосомы нитевидных колифагов М13, fl и fd, а также фагмиды, полученные на их основе.

 

© 2013 wikipage.com.ua - Дякуємо за посилання на wikipage.com.ua | Контакти